ŚWINIE COŚ O TYM WIEDZĄ: Niezwykle groźny składnik „szczepionek”
Szczepionki mRNA na COVID zmieniają ekspresję genów, skutkując osłabieniem systemu immunologicznego z pokolenia na pokolenia, przyczyniając się zatem do dalszego wzrostu chorób nowotworowych
2022-10-10
Poszczepienne choroby serca u młodych mężczyzn 12-29
2022-10-10
Nanofarmaceutyki pokryte glikolem polietylenowym (PEG) mogą wywoływać reakcje nadwrażliwości (HSR) o nasileniu łagodnym do ciężkiego, które niekiedy mogą zagrażać zdrowiu i życiu lub nawet być śmiertelne. Zjawisko to stanowi nierozwiązaną barierę immunologiczną w stosowaniu tych leków, jednak jego mechanizm jest słabo poznany. Niniejsze badanie wykazało, że pojedyncze wstrzyknięcie świniom i.v. niskiej dawki liposomów PEGylowanych (Doxebo) wywołuje masywny wzrost anty-PEG IgM we krwi, osiągający szczyt w dniach 7-9 i zmniejszający się w ciągu 6 tygodni. Bolusowe iniekcje PEG-liposomów w czasie serokonwersji powodowały wstrząs anafilaktoidalny (pseudoanafilaksję) w ciągu 2-3 minut, chociaż podobne zabiegi u badanych zwierząt prowadziły jedynie do łagodnych zaburzeń hemodynamicznych.
Pseudoanafilaksja na liposomy pokryte glikolem polietylenowym (PEG).
Rola IgM anty-PEG i aktywacji dopełniacza w świńskim modelu reakcji na infuzję u ludzi
OD TŁUMACZA:
Na rynku preparatów szczepionkowych od dwóch lat znajdują się w obiegu tzw. szczepionki mRNA oraz „szczepionki wektorowe” przeciwko COVID-19. Jednym z istotnych ujawnionych przez producentów składników każdego z tych specyfików jest polietyloglikol nazywany również glikolem polietylenowym (PEG). Jest to grupa syntetycznych polimerów tlenku etylenu uzyskanych w reakcji polimeryzacji kondensacyjnej. Ich struktura: długość łańcucha polimerowego, a tym samym wielkość cząsteczek jest zróżnicowana od kilku (np. PEG-6) do wielu tysięcy (np. PEG-25M) jednostek glikolu etylenowego w cząsteczce. To wielka grupa związków, stosowana między innymi w produkcji kosmetyków. W zależności od długości łańcucha i wielkości cząstek PEG-i mogą pełnić rolę: emulgatorów, rozpuszczalników, humektantów (substancji higroskopijnych zatrzymujących wodę), środków powierzchniowo czynnych (substancji myjących), substancji zwiększających lepkość kosmetyku, stabilizatorów, promotorów przenikania np. składników aktywnych. Do grupy PEG-ów należą np.:
- PEG-4 (Glikol polietylenowy oksyetylenowany 4 molami tlenku etylenu): humektant, składnik nawilżający;
- PEG-10 Cocoate (Kwasy tłuszczowe oleju kokosowego oksyetylenowane 10 molami tlenku etylenu): substancja myjąca, emulgator;
- PEG-8 Glyceryl Laurate (Monogliceryd kwasu laurynowego oksyetylenowany 8 molami tlenku etylenu): składnik ułatwiający tworzenie emulsji.
Jak czytamy na stronie kosmopedia.org: Wszystkie składniki należące do grupy PEG-ów stosowane w kosmetykach są bezpieczne dla konsumentów. Są to substancje o dobrze poznanym profilu toksykologicznym – nietoksyczne, nie wykazują działania mutagennego czy genotoskyczego. Mają też dobre właściwości dermatologiczne – nie działają drażniąco i uczulająco na skórę. Nie ma żadnych dowodów na to, że PEG-i są odpowiedzialne za wywoływanie stanu zapalnego skóry lub inne niekorzystne reakcje skórne.
W przypadku tzw. szczepionek przeciwko COVID-19 mamy jednak do czynienia z bezpośrednim kontaktem ludzkich komórek wewnętrznych z tymi związkami, co w sposób znaczący zmienia zakres ich toksyczności. Niniejszy artykuł opisuje doświadczenia przeprowadzone w latach 2018 – 2019 przez duży zespół naukowców na doświadczalnych świniach. W toku badań udowodnili oni wysoce toksyczne działanie PEG, którego skutkiem może być między innymi ostry stres oksydacyjny, gwałtowne reakcje uczuleniowe powodujące niebezpieczny wzrost ciśnienia w tętnicach płucnych, ostre niedotlenienie na poziomie komórkowym (krwi), bardzo gwałtowny spadek saturacji. Cała grupa tych reakcji została przez badaczy i jednoczesnie autorów niniejszego artykuły określona jako pseudoanafilaksja będąca odpowiedzią immunologiczną na PEG.
Według najnowszych szacowań, na polietylen glikolu jako składnik preparatów szczepionkowych uczulonych jest od 80 do 90 proc. ogólnej populacji ludzkiej.
Przedstawiając poniższy artykuł odwołuję się do Państwa rozsądku oraz do poszukiwania innych tego typu publikacji – jeszcze zanim zdecydują Państwo o przyjęciu pierwszej lub kolejnych dawek „szczepionki”.
Marek Skowroński
Autorzy: Gergely Tibor Kozma, Tamas Meszaros, Ildiko Vashegyi, Tamas Fulop, Erik Orfi, Laszlo Dezsi, Laszlo Rosivall, Yaelle Bavli, Rudolf Urbanics, Tom Eirik Mollnes, Yechezkel Barenholz,' i Janos Szebeni.
Centrum Badań i Edukacji w zakresie nanomedycyny, Uniwersytet Semmelweisa, Budapeszt 1089, Węgry SeroScience Ltd., Budapeszt 1125, Węgry, oraz Cambridge, Massachusetts 02138, Stany Zjednoczone
Department of Pathophysiology, International Nephrology Research and Training Center, Semmelweis University, Budapest 1089, Hungary
Laboratorium Badań nad Membranami i Liposomami, IMRIC, Hebrew University-Hadassah Medical School, Jerozolima 9112102, Izrael Oddział Immunologii, Szpital Uniwersytecki w Oslo, Rikshospitalet, Oslo 0372, Norwegia
Laboratorium Badawcze, Szpital Nordland w Bodø, Wydział Nauk o Zdrowiu i TREC, Uniwersytet w Tromsø, Tromsø 9019, Norwegia
Centrum Badań Molekularnych nad Zapaleniem, Norweski Uniwersytet Nauki i Technologii, Trondheim 7012, Norwegia 0Wydział Nanobiotechnologii i Medycyny Regeneracyjnej, Wydział Zdrowia, Uniwersytet w Miszkolcu, Miszkolc 3515, Węgry
STRESZCZENIE:
Nanofarmaceutyki pokryte glikolem polietylenowym (PEG) mogą wywoływać reakcje nadwrażliwości (HSR) o nasileniu łagodnym do ciężkiego, które niekiedy mogą zagrażać zdrowiu i życiu lub nawet być śmiertelne. Zjawisko to stanowi nierozwiązaną barierę immunologiczną w stosowaniu tych leków, jednak jego mechanizm jest słabo poznany. Niniejsze badanie wykazało, że pojedyncze wstrzyknięcie świniom i.v. niskiej dawki liposomów PEGylowanych (Doxebo) wywołuje masywny wzrost anty-PEG IgM we krwi, osiągający szczyt w dniach 7-9 i zmniejszający się w ciągu 6 tygodni. Bolusowe iniekcje PEG-liposomów w czasie serokonwersji powodowały wstrząs anafilaktoidalny (pseudoanafilaksję) w ciągu 2-3 minut, chociaż podobne zabiegi u badanych zwierząt prowadziły jedynie do łagodnych zaburzeń hemodynamicznych. Równoległe pomiary ciśnienia w tętnicy płucnej (PAP) i sC5b-9 we krwi, traktowane odpowiednio jako miary HSR i aktywacji dopełniacza, wykazały zgodny wzrost obu zmiennych w ciągu 3 min i spadek w ciągu 15 min, sugerując związek przyczynowy między aktywacją dopełniacza a nadciśnieniem płucnym. Zaobserwowaliśmy również szybki spadek anty-PEG IgM we krwi w ciągu kilku minut, zwiększone wiązanie liposomów PEGylowanych do komórek B IgM+ w śledzionie immunizowanych zwierząt w porównaniu z kontrolą i zwiększoną konwersję C3 przez liposomy PEGylowane w surowicy immunizowanych świń. Te obserwacje razem wzięte sugerują szybkie wiązanie anty-PEG IgM do PEGylowanych liposomów, co prowadzi do aktywacji dopełniacza na drodze klasycznej, pociągając za sobą wstrząs anafilaktoidalny i przyspieszony klirens krwi kompleksów liposom-IgM. Dane te sugerują, że aktywacja dopełniacza odgrywa rolę przyczynową w ciężkich HSR na nanomedycyny PEGylowane i że świnie mogą być wykorzystane jako model identyfikacji zagrożeń do oceny ryzyka HSR w przedklinicznych badaniach bezpieczeństwa.
SŁOWA KLUCZOWE: alergia, liposomy, anafilatoksyny, modele zwierzęce, immunoglobuliny, wstrząs anafilaktoidalny, nadciśnienie płucne
Rys. 1
- glikole polietylenowe (PEG), wysoce uwodnione nieporęczne polimery w zakresie 0,5-40 kDa były szeroko stosowane do czasu zgłoszenia zastrzeżenia, to jest do 21 maja 2019 roku.
- poprawa skuteczności terapeutycznej liposomów i białek będących nośnikami leków poprzez wydłużenie czasu ich krążenia do czasu ich zatwierdzenia, to jest do 26 lipca 2019 roku.
Opublikowano: 26 lipca 2019 roku
Nierozwiązanym problemem związanym z takimi nanofarmaceutykami PEGylowanymi jest ich rozpoznawanie przez układ immunologiczny, objawiające się reakcjami nadwrażliwości (HSR) nieukierunkowanymi IgE (pseudoalergicznymi), czyli niepożądanym odczynem poszczepiennym (NOP) powszechnie nazywanym reakcją po infuzji.1-7 Do nanoleków PEGylowanych, o których donoszono, że wywołują takie reakcje, należą PEGylowana liposomalna doksorubicyna (Doxil/Caelyx)8, PEGylowany G-CSF (pegfilgrastim, Neulasta)9, PEGylowana erytropoetyna (mono-mPEG-epoetyna-β, Mircera)10, PEGylowany rekombinowany ludzki czynnik VIII (Adynovate)11 i PEGylowana amoniakalna liaza fenyloalaninowa (pegvaliase-pqpz, Palynziq)12, przy czym co najmniej trzy preparaty zostały wycofane z użycia klinicznego częściowo z powodu ciężkich HSR (wskaźnik procentowego wysycenia tlenem hemoglobiny, który wynosi od 95% do 99%. – przyp. tłum.): PEGylowany peptyd mimetyczny EPO (peginesatide, Omontys)13, PEGylowana oksydaza moczanowa (pegloticase, Krystexxa)14 oraz PEGylowany aptamer RNA blokujący IXa (pegnivacogin, Revolixys)15
Objawy, takie jak duszność, zaczerwienienie i obrzęk twarzy, ból w klatce piersiowej, ból pleców, migotanie przedsionków lub komór, wysypka, dreszcze, napadowe bóle głowy i gorączka, pojawiają się najczęściej wkrótce po przyjęciu pierwszej dawki lub pierwszych dawek, chociaż obserwuje się również reakcje rozpoczynające się później bądź po wielokrotnym leczeniu. W większości przypadków problem ustępuje samoistnie albo może być łatwo kontrolowany, jednak czasami reakcja może eskalować do pseudoanafilaksji, ciężkiej, czasami śmiertelnej formy reakcji infuzyjnych przypominających anafilaksję, w której IgE (immunoglobiny E, jednego z pięciu rodzajów ludzkich przeciwciał; inne rodzaje to IgA, IgG, IgM oraz IgD i każdy z nich ma zdolność rozpoznawania określonego rodzaju antygenów czyli czynników wywołujących alergię i reagowania na te antygeny – przyp. tłum.) nie odgrywają roli. Jest ona również znana jako reakcja anafilaktoidalna lub wstrząs anafilaktoidalny.
Takie HSR, z okazjonalną pseudoanafilaksją, nie ograniczają się do leków PEGylowanych, ale są wywoływane przez wiele różnych leków podawanych dożylnie, w tym przez leki micelarne, środki kontrastowe, leki biologiczne, terapie enzymatyczne, związki żelaza, a nawet małe cząsteczki.3,7 Zjawisko to stanowi istotny problem kliniczny, regulacyjny i przemysłowy, ale jego mechanizm immunologiczny jest nadal daleki od zrozumienia mimo ponad 100 lat, jakie upłynęły od odkrycia anafilaksji.5 Przewidywanie ciężkich reakcji jest obecnie niepewne, a zapobieganie i leczenie są nadal empiryczne i objawowe.1-7
Aby lepiej zrozumieć te reakcje i pomóc w ich przewidywaniu i zapobieganiu, w niniejszym badaniu wykorzystano model pseudoalergii związanej z aktywacją dopełniacza u świń (CARPA)16-19, który, jak opisano wcześniej, wykazuje typowe objawy anafilaksji sercowej16, w której przyczyną nagłego zgonu jest wstrząs z zatrzymaniem krążenia. Wykorzystaliśmy ten model do odkrycia mechanizmu immunologicznego leżącego u podstaw HSRs na leki PEGylowane, przyjmując jako czynniki modelowe PEGylowaną liposomalną doksorubicynę (Doxil/Caelyx) i jej postać bez leku, placebo Doxil (Doxebo)20. Dostarczając dowodów na związek przyczynowy między indukcją przeciwciał anty-PEG, aktywacją dopełniacza i pseudoanafilaksją, obecne dane podkreślają mechanizm wywołanych przez Doxil ciężkich HSR i wykorzystanie modelu świńskiego w zrozumieniu i przewidywaniu tego typu toksyczności immunologicznej nanofarmaceutyków z PEG.
WYNIKI I DYSKUSJA:
Immunogenność Doxebo.
Pojedyncze i.v. leczenie świń niską dawką (0,1 mg fosfolipidu (PL)/kg) Doxebo prowadziło do ogromnego wzrostu przeciwciał anty-PEG IgM i równoległego mniejszego wzrostu przeciwciał anty-PEG IgG (Abs) (ryc. 2). Panele A i B przedstawiają miana odpowiednio w skali liniowej i logarytmicznej, przy czym ta ostatnia wzmacnia dolny obszar zmian miana. Wzrost Abs rozpoczął się w 3. dniu po leczeniu, a miana osiągnęły szczyt między 7. a 9. dniem i powróciły do poziomu zbliżonego do wyjściowego po 4-6 tygodniach. Zasadniczo podobne, choć mniej wyrażone miana uzyskano, gdy całe Doxebo było używane jako antygen w teście ELISA (dane nie pokazane).
Ryc. 2. Immunogenność Doxebo z mianami anty-PEG Ab przedstawionymi zarówno w skali liniowej (A), jak i logarytmicznej (B). Jednostki są zdefiniowane w Materiałach i Metodach. Punkty reprezentują medianę + zakres międzykwartylowy (IQR); miana od n świń określone powyżej krzywych w każdym punkcie czasowym w panelu A. Wartość n =19 na linii podstawowej jest wyjaśniona przez nasze połączenie pomiarów Ab u immunizowanych ( n = 12) i nieimmunizowanych (n = 7) świń tylko w tym czasie. Nieimmunizowane świnie nie wykazały wzrostu miana Ab. Poddanie tych danych testowi Kolmogorova-Smirnova nie wykazało gaussowskiego rozkładu mian we wszystkich dniach, stąd prezentacja mediany + IQR. Test Kruskala-Wallisa, po którym nastąpiło wielokrotne porównanie Dunna, wykazał znaczącą różnicę w stosunku do linii podstawowej w każdym dniu od 3 do 14 (*, P < 0,05 lub **, P < 0,01). Szczegóły testu ELISA zostały opisane w Materiałach i Metodach.
Kolejną obserwacją w omawianych doświadczeniach (widoczną tylko na ryc. 2B) było to, że poziomy anty-PEG IgM/IgG nie były zerowe na linii podstawowej (czas 0), co wskazuje na obecność istniejących wcześniej (naturalnych) przeciwciał anty-PEG. Miano anty-PEG IgM znacznie różniło się u zwierząt w zakresie 20-1000 jednostek, przy czym IgM znajdowało się w zakresie o rząd wielkości wyższym niż IgG (rysunek 2B, oś y, dopasowane kolorystycznie końcówki pasków błędów). Kolejnym nieoczekiwanym odkryciem na rysunku 2B było to, że początkowe miana zarówno anty-PEG IgM jak i IgG spadły w dniach 1-2 po immunizacji Doxebo.
Usuwanie anty-PEG IgM ma taki sam przebieg czasowy jak reakcje na infuzję. Doświadczenie z rysunku 2B wykazało spadek anty-PEG IgM i IgG w ciągu jednego dnia po immunizacji Doxebo, chociaż dokładna kinetyka tego spadku pozostała nierozstrzygnięta w krótszym czasie. Ponieważ HSR na Doxil występuje w skali czasowej minut20, kwestią szczególnie interesującą do zbadania była możliwa koincydencja tych zmian. Zgodnie z tym, w następnej serii doświadczeń badanym świniom wstrzyknięto bolus (podanie leku w dużej dawce, mające na celu uzyskanie efektywnego stężenia w tkankach w jak najkrótszym czasie - przyp. tłum.) z Doxilu i zmierzyliśmy zarówno wzrost ciśnienia w tętnicy płucnej (PAP) (miara HSR, ryc 3A) i poziom anty-PEG IgM we krwi (ryc. 3B i 3C) w minutowej skali czasu. Zgodnie z wcześniejszymi danymi20 wstrzyknięcie bolusa Doxilu prowadziło do znacznego wzrostu ciśnienia w tętnicy płucnej w ciągu 2 minut, a wartości powróciły do poziomu wyjściowego w ciągu 7-10 minut (ryc. 3A). Podobne leczenie zwierząt z Doxebo we wcześniejszym badaniu20 miało podobne wyniki, chociaż łagodniejszą reakcję płucną (wstawka na rycinie 3A). Co było wielkim zaskoczeniem, to poziom IgM anty-PEG we krwi spadł w tym samym przedziale czasowym, w którym wystąpił HSR, z wyraźnym podziałem na dwie fazy; po gwałtownym spadku w ciągu 1 min nastąpił powolny spadek w ciągu 15 min (ryc. 3B). Ten ostatni proces był spójny i powtarzalny u 5 świń (ryc. 3C), umożliwiając wysoce znaczące dopasowanie krzywej logarytmicznej (R2 = 0,997) typowej dla biologicznych reakcji pierwszego rzędu. Co ważne, korelacja zmian miana anty-PEG IgM z nadciśnieniem płucnym również wykazała wysoce istotną korelację (R2 = 0,97, Figura 2D). Dane te razem wzięte dostarczają ilościowych dowodów na związek przyczynowy między spadkiem naturalnie występującego anty-PEG IgM a HSR wywołanym przez Doxil.
Ryc. 3. Zmiany hemodynamiczne i poziomy IgM anty-PEG w osoczu u (naiwnych) świń wstrzykiwanych z liposomami PEGylowanymi. (A) Nadciśnienie płucne wywołane wstrzyknięciem bolusa 0,1 mg PL/kg Doxilu. Punkty przedstawiają medianę + IQR, n = 5. Test Friedmana, a następnie test wielokrotnych porównań Dunna wykazały, że wartości 1-4 min były znacząco różne od wartości wyjściowych (**, P < 0,01 lub *, P < 0,05). Wstawka ilustruje efekt Doxebo, zgłoszony w ref 20. (B) Miano anty-PEG IgM w osoczu jako funkcja czasu po wstrzyknięciu 0,1 mg/kg Doxilu. Typowe wartości u 1 z 5 świń. (C) Miano IgM anty-PEG w osoczu po wstrzyknięciu 0,1 mg/kg Doxilu, % odczytów z 1 minuty, średnia + SEM, n = 5. Jednofazowe dopasowanie krzywej logarytmicznej dało R2 równe 0,997, co jest wysoce znaczące. (D) Korelacja pomiędzy względnymi zmianami miana anty-PEG IgM i płucnego ciśnienia tętniczego po wstrzyknięciu 0,1 mg/kg Doxilu, z odczytami 1 min jako wartości wyjściowej. Wartości to średnia + SEM, n = 5. Pearson R2 = 0,966 wskazuje na wysoce istotną korelację.
Zwiększona reaktogenność liposomów PEGylowanych u świń immunizowanych Doxebo. Jeśli anty-PEG IgM odgrywa rolę przyczynową w HSR wywołanych przez Doxil, jak sugerują dane z ryc. 3, oczekuje się, że celowe podniesienie tych Abs poprzez immunizację Doxebo (ryc. 2) zwiększy reaktogenność liposomów PEG. Eksperymenty przedstawione na rycinie 4 potwierdziły to przewidywanie z nieoczekiwaną mocą. Bolusowe wstrzyknięcia Doxebo i Doxilu u 5 immunizowanych świń doprowadziły w ciągu 2 minut do zagrażającego życiu HSR u jednego i śmiertelnej pseudoanafilaksji wymagającej resuscytacji u 4 zwierząt, niezależnie od czasu wykonania testu w 2-6-tygodniowym przedziale serokonwersji. Jak pokazano na rysunku 4A u zwierzęcia, które przeżyło, wzrost ciśnienia w tętnicy płucnej był znaczny zarówno pod względem amplitudy, jak i czasu trwania w porównaniu z obserwowanym u zwierząt badanych (ryc. 3A), a my obserwowaliśmy znaczące zmiany średniego ciśnienia tętniczego (SAP) i częstości akcji serca (HR) nawet po wielokrotnych wstrzyknięciach liposomów (ryc. 4A). Sugeruje to utratę tachyfilaksji (samotolerancji), która jest charakterystyczną cechą reakcji Doxilu u badanych świń i uważa się, że jest spowodowana wyczerpaniem naturalnych przeciwciał,20 dla którego uzyskaliśmy dowody na ryc. 3B i C. Tak więc zużycie reaktywnych przeciwciał podczas pierwszej reakcji nie wystarczyło do wyczerpania ich do poziomu niereaktywnego. Rycina 4B ilustruje śmiertelną pseudoanafilaksję z maksymalnym wzrostem ciśnienia tętnicy płucnej i wstrząsem rozwijającym się w ciągu 2 minut. Panel ilustruje również momenty resuscytacji za pomocą masażu serca i epinefryny, co skutkowało przekroczeniem SAP. Rycina 4C pokazuje, że te ciężkie reakcje były związane z rozległym rumieniem i wysypką w ciągu 3 min.
Jeśli chodzi o zależność dawka-skutek między anty-PEG IgM a HSR u immunizowanych świń, poza potrzebą lub brakiem potrzeby resuscytacji, reakcje były ilościowo nieodróżnialne niezależnie od rzeczywistych - znacznie podwyższonych - mian anty-PEG IgM w czasie eksperymentu. Sugeruje to, że znacząca korelacja między anty-PEG IgM i HSR uzyskana dla zwierząt badawczych (ryc. 3D) nie ma zastosowania u immunizowanych świń, ponieważ ilość anty-PEG IgM we krwi znacznie przekracza plateau (równy poziom, nasycenie – przyp. tłum.) dynamicznego zakresu zależności dawka-skutek, którego dokładne granice pozostają do określenia.
Dowody na rolę aktywacji dopełniacza w wywołaniu wstrząsu rzekomoanafilaktycznego przez liposom PEG u immunizowanych świń. Dane na rycinie 4 ujawniają skuteczne uwrażliwienie zwierząt na HSR wywołane przez PEGylowane liposomy poprzez indukowany immunizacją wzrost anty-PEG IgM, co jest zgodne z przyczynową rolą tych Abs w tym zjawisku. Jeśli chodzi o dokładny mechanizm związku przyczynowo-skutkowego, biorąc pod uwagę, że IgM związana z antygenem jest jednym z najsilniejszych aktywatorów układu dopełniacza na drodze klasycznej oraz że istnieje wiele dowodów na poparcie teorii CARPA, tj. że aktywacja dopełniacza odgrywa rolę przyczynową w wielu HSR (tabela pomocnicza 1), aktywacja dopełniacza stanowi oczywisty związek między anty-PEG IgM a HSR. Jednakże, taki związek miał do tej pory tylko pośrednie wsparcie doświadczalne, a wzrost produktów ubocznych aktywacji dopełniacza we krwi świni podczas HSR nigdy nie został16-21 wykazany.
Aby wypełnić tę lukę informacyjną, zmierzyliśmy poziomy rozpuszczalnego terminalnego kompleksu dopełniacza świń (sC5b-9) w osoczu immunizowanych świń podczas pierwszych masywnych zaburzeń hemodynamicznych wywołanych Doxebo (ryc. 4A i 4B). Rycina 5A pokazuje, że nadciśnienie płucne u tych zwierząt było ściśle powiązane ze wzrostem sC5b-9 we krwi i, zgodnie z faktem, że sC5b-9 jest końcowym produktem kaskady aktywacji dopełniacza, jego szczyt w około 3 min był nieco opóźniony w stosunku do szczytu krzywej PAP. W tym czasie wzrost sC5b-9 był znaczący w stosunku do linii podstawowej, a korelacja między PAP i sC5b-9 była silna, gdy obszary pod krzywą (AUC) odpowiedzi dopełniacza i PAP były analizowane za pomocą regresji liniowej (ryc. 5B). Dane te potwierdzają zatem związek przyczynowy między aktywacją dopełniacza a HSR.
Ryc. 4. Reaktogenność PEGylowanych liposomów u świń immunizowanych Doxebo. (A) Zmiany hemodynamiczne u jednego z 5 zwierząt, wykazujące ciężką, ale nie śmiertelną reakcję na powtarzane iniekcje określonych dawek liposomów 4 tygodnie po immunizacji. (B) wstrząs rzekomoanafilaktyczny u innej świni, ilustrujący reakcję 4 z 5 immunizowanych świń badanych w odstępie 2-6 tygodni po immunizacji. W zapisie hemodynamicznym w czasie rzeczywistym, szum o dużej amplitudzie zbiegł się z masażem serca. (C) Brzuszny obszar skóry przed ("kontrola") i 3 min po wstrzyknięciu Doxebo, pokazujący konfluentne zaczerwienienie skóry i wysypkę obserwowane u wszystkich 5 świń. Obiekty na zdjęciach obejmują trójdrożny kurek podłączony do przetwornika ciśnienia i strzykawkę używaną do nadmuchiwania balonu spinaker cewnika Swan-Ganza (patrz Materiały i Metody).
Ryc. 5. Wywołana przez Doxebo aktywacja dopełniacza (sC5b-9) i nadciśnienie płucne (PAP) u świń immunizowanych Doxebo. (A) Przebieg czasowy PAP (czerwony) i równoczesne zmiany sC5b-9 (niebieski) po prowokacji liposomem. Punkty reprezentują medianę + IQR u 4 świń, u których próbki krwi mogły być pobrane. Zarówno wartości PAP jak i sC5b-9 różniły się statystycznie od wartości wyjściowych (0 min) przy *P < 0,05 i **P < 0,01, uzyskanych testem Friedmana, a następnie testem wielokrotnego porównania Dunna. (B) Korelacja pomiędzy wartościami pola powierzchni pod krzywą (AUC) PAP i sC5b-9 w czasie 10 min za pomocą testu korelacji Pearsona (P = 0,07, R2 = 0,864).
Dowody ex vivo na wytwarzanie przez śledzionę IgM wiążącej liposomy przeciwko PEG. Dalsze pytania, jakie nasuwają się w związku z powyższymi wynikami, dotyczą źródła narządowego anty-PEG IgM oraz mechanizmu jej szybkiego usuwania. W eksperymencie dotyczącym tych pytań przygotowaliśmy zawiesiny komórek śledziony od immunizowanej i kontrolnej świni w 9 dniu po immunizacji i zmierzyliśmy metodą cytometrii przepływowej wiązanie Doxilu z komórkami IgM+ B in vitro. Wyraźnie zauważalny wzrost liczby komórek Doxil+ w prawej górnej bramce na Figurze 5C vs A wskazuje na wiązanie Doxilu do komórek IgM+ nawet u zwierząt kontrolnych. Co najbardziej zauważalne, liczba komórek IgM+/Doxil+ potroiła się u immunizowanych zwierząt w porównaniu z kontrolą (ryc. 6D vs C), wskazując na znaczną proliferację komórek wiążących Doxil u immunizowanych świń. Obserwacje te są zgodne z obecnością IgM wiążących Doxil przeciwko PEG na powierzchni prawidłowych (badanych) splenocytów (komórek wytwarzanych przez śledzione – przyp. tłum.) świńskich i znacznym wzrostem tych komórek po immunizacji. Uwolnienie tych Abs do krążenia u zwierząt badawczych może być jednym ze źródeł naturalnych anty-PEG IgM we krwi świń, podczas gdy zwiększone uwalnianie tych Abs do krwi wyjaśnia podwyższone anty-PEG IgM u immunizowanych świń. Ponadto, wiązanie się Doxilu z tymi Abs na komórkach B dostarcza dowodów na zdolność Doxebo/Doxilu do wiązania się z tymi Abs w krążeniu. Te odkrycia i wyjaśnienia razem wzięte wspierają propozycję, że wiązanie anty-PEG IgM z Doxebo/Doxil we krwi wyjaśnia aktywację dopełniacza, która pociąga za sobą produkcję anafilatoksyny i opsonizację lizosomów. Pierwszy proces wyjaśnia HSR, podczas gdy drugi jest zgodny z pierwszorzędowym usuwaniem anty-PEG IgM przez system fagocytów jednojądrowych obserwowanych na ryc. 3B i C, najprawdopodobniej jako pojedyncze lub wielokrotne kompleksy liposom-Ab.
Ryc. 6. Wpływ immunizacji Doxebo na wiązanie Doxilu do komórek B śledziony. Komórki śledziony pobrane od immunizowanego i kontrolnego zwierzęcia 9 dni po immunizacji poddano ekspozycji na znakowane FITC anty-IgM i fluorescencyjny Doxil in vitro, a frakcję komórek wiążących FITC-IgM i / lub Doxil określono w cytometrze przepływowym. Panele A-D pokazują rozkład komórek wykazujących różne stopnie fluorescencji IgM i Doxilu u zwierząt immunizowanych i kontrolnych. Prawy górny kwadrant stanowi bramkę dla komórek IgM+/Doxil+. Str-FITC, streptawidyna-FITS.
Dowody in vitro na zwiększoną aktywację dopełniacza przez Doxil w surowicy immunizowanych świń. Wzrost sC5b-9 podczas masywnej niewydolności krążeniowo-oddechowej u immunizowanych zwierząt (ryc. 5A) był znaczący, ale stosunkowo niewielki (2-krotny), więc szukaliśmy innych, niezależnych dowodów na aktywację dopełniacza przez Doxil we krwi świni. Jak pokazano na ryc. 5, inkubacja Doxilu z immunizowaną vs naiwną surowicą świń prowadziła do znacznie zwiększonego zużycia C3 w surowicy odpornościowej. Chociaż efekt zymosanu był również wyższy w tej ostatniej surowicy, względna zmiana była znacznie większa w przypadku Doxilu, co jest zgodne z aktywacją dopełniacza na drodze klasycznej z powodu wiązania anty-PEG IgM.
Ryc. 7. Przyspieszenie aktywacji dopełniacza przez anty-PEG IgM w surowicy świni in vitro. Doxil (3 mg PL/mL) i zymosan (0,3 mg/mL) inkubowano z surowicą świni uodpornionej na Doxebo (miano: 36,843) i kontrolnej (naiwnej) (miano: 122) w temperaturze 37 °C przez 45 minut, a zużycie C3 mierzono za pomocą testu Pan C3 firmy Quidel. Immunizacja była taka sama jak na ryc. 1.
WNIOSKI:
Mechanizm HSR do PEGylowanych Nanomedycyny: Piecing the Steps Together. Na podstawie długiej listy dowodów na przyczynową rolę aktywacji dopełniacza w niektórych HSR wywołanych przez liposomy (Suplement Tabela 1) zaproponowaliśmy wcześniej, że CARPA stanowi główny mechanizm reakcji na infuzję do różnych leków i środków nanocząsteczkowych.21,22 Jednak ostatnio rola dopełniacza w reakcjach na infuzję została zakwestionowana23 na podstawie eksperymentu, który nie wykazał aktywacji dopełniacza przez nanocząstkę polistyrenową we krwi świni in vitro, chociaż spowodowała ona reakcje płucne u świń in vivo.24 Chociaż ważność tych danych in vitro i uogólnienie wniosków było dyskutowane,25,26 ostateczne pytanie, jaki jest udział aktywacji dopełniacza w wywołanych przez nanocząstki zaburzeniach krążeniowo-oddechowych u świń w porównaniu z innymi mechanizmami, pozostało otwarte. To pytanie jest szczególnie istotne w przypadku Doxilu, ponieważ wykazano, że aktywuje on dopełniacz u człowieka zarówno in vitro27, jak i in vivo28 ale u pacjentów z rakiem infuzji tego leku, tylko silna aktywacja dopełniacza może być związana z HSRs.28 Ponadto, bezpośrednie dowody na aktywację dopełniacza u świń za HSRs na Doxil nigdy wcześniej nie zostały przedstawione. Nasze obecne dane wykazujące znaczącą korelację między nadciśnieniem płucnym a wzrostem sC5b-9 we krwi zwierząt uczulonych na aktywację C wywołaną przez Ab stanowią bezpośredni dowód, że aktywacja dopełniacza może odgrywać rolę przyczynową w zaburzeniach krążeniowo-oddechowych świń. Ponadto, przyspieszenie zaburzeń sercowo-naczyniowych do pseudo anafilaksji u immunizowanych zwierząt wykazujących wysokie miano anty-PEG IgM we krwi, wraz ze zwiększoną konwersją C3 przez Doxil w surowicy świni immunizowanej w porównaniu z surowicą świni naiwnej oraz przyspieszonym klirensem anty-PEG IgM w tym samym czasie, w którym postępuje aktywacja dopełniacza i reakcja sercowo-płucna, sugeruje związek przyczynowy nie tylko między aktywacją C i reakcją płucną, ale także między poziomami anty-PEG IgM we krwi i aktywacją dopełniacza. Te procesy razem wzięte sugerują całościowy schemat reakcji przedstawiony na rycinie 8, ilustrujący sekwencję etapów reakcji wzdłuż osi immuno-krążenia: najpierw wiązanie Abs do liposomów powodujące aktywację dopełniacza, uwolnienie anafilatoksyn i innych produktów rozszczepienia dopełniacza oraz ich działanie stymulujące na komórki odporności wrodzonej wywołujące alergię, pociągające za sobą wydzielanie mediatorów wazoaktywnych i zapalnych, które są odpowiedzialne za objawy HSR.
U świń, płucne makrofagi wewnątrznaczyniowe (komórki PIM) prawdopodobnie odgrywają główną rolę w uczulaniu modelu,17 20,23 25,39 41 ale udział w HSR innych komórek wydzielniczych wrażliwych na anafilatoksynę i/lub wymiatających cząsteczki (komórki Kupffera, mastocytów, komórek dendrytycznych, płytek krwi i granulocytów), podobnie jak nie można wykluczyć udziału niezależnej od dopełniacza stymulacji tych komórek, określanej jako pseudoalergia niezależna od dopełniacza (CIPA)2^29 (Rycina 8). Te równoczesne efekty stymulujące są określone przez hipotezę "podwójnego uderzenia" zaproponowaną wcześniej dla HSR wywołanych przez Doxil u świń,20 która może być rozszerzona do „wielokrotnego uderzenia” przez inne potencjalne sygnały stymulujące komórki odporności wrodzonej, jak zilustrowano na ryc. 8. Należy zauważyć, że fagocytoza nanocząstek, jak sugeruje hipoteza „szybkiej odpowiedzi fagocytarnej”,23,24 stanowi inny możliwy mechanizm przyczyniający się do HSRs, ale prawdopodobnie ma zastosowanie do nanocząstek C3b/iC3b/C3dg-opsonizowanych26 tylko w zakresie, w jakim komórki fagocytarne mogą je internalizować w ciągu 2 minut. Idea szybkiej fagocytozy niezależnej od dopełniacza pozostaje do udowodnienia;23 jednak jest mało prawdopodobne, aby dotyczyła liposomów PEGylowanych, o których wiadomo, że fagocytoza jest hamowana przez powłokę PEG.
Ryc. 8. Kompleksowy schemat mechanistyczny pseudoalergicznych reakcji infuzyjnych na Doxil i inne nanocząstki PEGylowane: znane i hipotetyczne szlaki kaskady reakcji. PEGylowane liposomy wiążą anty-PEG Abs, które aktywują dopełniacz na drodze klasycznej (CP). Uwolnione produkty rozszczepienia dopełniacza stymulują szereg komórek odporności wrodzonej i komórek krwi (np. komórki PIM, makrofagi, komórki tuczne, bazofile, granulocyty, płytki krwi) poprzez różne receptory, zilustrowane kolorowymi strzałkami i kształtami powierzchni dla różnych receptorów. Te szlaki sygnałowe reprezentują CARPA, ale alergizujące komórki fagocytarne mogą być również aktywowane bez udziału dopełniacza, co określane jest jako pseudoalergia niezależna od dopełniacza (CIPA). Strzałki skierowane na zewnątrz przedstawiają znane produkty wydzielnicze, które mogą pośredniczyć w powstawaniu objawów alergii. Linie ciągłe i przerywane reprezentują znane i hipotetyczne mechanizmy aktywacji. Skróty: ATR, receptor anafilatoksyn; „szlak opsoninowy” C3b, pośredniczony przez C3b, iC3b i C3d(g) poprzez CR1 (CD35), CR2 (CD21) i CR3 (CD11b/CD18) (niebieski); "szlak C1q-C1qR" (brązowy); "szlak MBL/ficolin-MBL-R" (czerwony); „szlak bezpośredniej stymulacji kompleksu dopełniacza końcowego (C5b-9)” (niebieski); potencjalne dodatkowe mechanizmy stymulacji obejmują wiązanie IgG/IgM z udziałem Fc do Fc/RIIB (CD32)/FcyR (CD351) (fioletowy); oraz wiązanie PEG do receptorów rozpoznawania wzorców (PRR), np. g., receptora Toll-podobnego 2 i/lub 6 i/lub innych PRR, w wyniku naśladowania wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP) (zielony).
Wyjaśnienia dotyczące eliminacji anty-PEG IgM. Gwałtowny spadek miana anty-PEG IgM w osoczu naiwnych świń w ciągu pierwszej minuty po wstrzyknięciu Doxilu (rysunek 2B) może mieć przyczyny ex vivo i in vivo, w tym konkurencyjne hamowanie wychwytu anty-PEG IgM przez wolne liposomy w płytce ELISA oraz indukowane przez IgM poliwalentne wiązanie wielu pęcherzyków in vivo, pociągające za sobą agregację i sekwestrację w kapilarach. Możliwości te wymagają dalszych badań. Niemniej jednak, późniejszy zanik pierwszego rzędu anty-PEG IgM w ciągu 10-15 minut, który można modelować za pomocą prawie doskonałego równania logarytmicznego, odzwierciedla proces biologiczny, którego szybkość jest proporcjonalna do ilości, która pozostała. W naszym przypadku procesem tym jest najprawdopodobniej wymiatanie kompleksów skrobiawica-IgM przez komórki układu fagocytów jednojądrzastych (MPS) z fagocytozą lub bez niej, zjawisko znane jako przyspieszony klirens krwi (ABC).30-35
Koncepcja „pierwotnego ABC”. W ABC, badanym od prawie dwie dekady głównie na modelach mysich,30-35 szybki klirens liposomów przypisano wiązaniu anty-PEG IgM do pęcherzyków, co pociąga za sobą aktywację dopełniacza, opsonizację i szybki klirens przez MPS. Wykazano, że te anty-PEG Abs były tworzone w komórkach B strefy brzeżnej śledziony w wyniku immunizacji niezależnej od komórek T przez wcześniejsze wstrzyknięcie liposomów PEGylated.32-35 Zasadniczą różnicą między powyższym „klasycznym” ABC a naszymi obserwacjami dotyczącymi szybkiego klirensu anty-PEG IgM jest to, że ten drugi proces występuje już po pierwszym wstrzyknięciu liposomów; nie ma primingu (rysunek 3B i 3C). Zakładając, że anty-PEG IgM przechodzące szybki klirens było związane z liposomami, odkrycie to sugeruje, że istniejące wcześniej, naturalnie występujące anty-PEG IgM mogą podobnie usuwać liposomy, jak indukowane Abs w „klasycznym” ABC. Tak więc, szybki zanik anty-PEG IgM przedstawiony na rysunku 2B i C może odzwierciedlać „pierwotne” ABC z wieloma cechami „wtórnego” ABC. Zgodnie z tym, pierwotne ABC i CARPA mogą stanowić „dwie strony tej samej monety”,35 co nasuwa pytanie, dlaczego HSR nigdy nie został zgłoszony podczas wtórnego ABC u szczurów i myszy. Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem jest to, że te gatunki mają o rząd wielkości niższą wrażliwość na HSR niż świnie lub nadwrażliwi ludzie.29,36 To właśnie wysoka wrażliwość modelu świńskiego na HSR umożliwiła odkrycie tej dwoistości.
Bezpośrednie dowody na wiązanie IgM z Doxil. O swoistym wiązaniu pomiędzy liposomami znakowanymi PEG a anty-PEG IgM podczas wtórnego ABC w modelach mysich wnioskowano między innymi na podstawie cytometrycznej analizy przepływowej wiązania znakowanych fluorescencyjnie liposomów znakowanych PEG do komórek śledziony pobudzonych liposomami in vitro, co korelowało z wytwarzaniem przeciwciał anty-PEG, oznaczanych metodą ELISA.37,38 Starając się odtworzyć tę obserwację w przypadku splenocytów świńskich uzyskanych od świń naiwnych i immunizowanych w naszym badaniu, przeprowadziliśmy eksperymenty cytometrii przepływowej pokazane na rycinie 6. Dane wskazały na obecność związanej z liposomem anty-PEG IgM na komórkach B śledziony (nawet u zwierząt naiwnych), których liczba znacznie wzrosła po immunizacji, prowadząc do zwiększonego wiązania Doxilu. Te obserwacje ex vivo w hodowli komórkowej są zgodne ze wszystkimi wynikami in vivo u świń i wskazują na komórki B śledziony jako prawdopodobne źródło anty-PEG IgM również u świń.
Krytyka modelu świńskiego. Niedawno twierdzono, że model świński zastosowany w tym badaniu nie ma znaczenia dla przeciętnego pacjenta ludzkiego i dlatego jest mylący dla oceny ryzyka HSR wywołanych przez nanomedycynę.23,39-41 Powody tego poglądu obejmowały różnicę w częstości HSR u świń i przeciętnego człowieka, różne podstawowe mechanizmy immunologiczne i „globalność” reakcji sercowo-płucnych. Aby wyjaśnić możliwe nieporozumienia, które doprowadziły do powyższych wniosków, ważne wydaje się ponowne podkreślenie18,19,25, że model świni nie jest tradycyjnym modelem immunotoksykologicznym, w którym toksyczność leków na układ odpornościowy jest oceniana u zdrowych zwierząt, aby przewidzieć możliwe niekorzystne efekty immunologiczne u immunologicznie normalnych ludzi. Podobnie jak inne zwierzęce modele alergii, model świński jest modelem choroby alergicznej, tzn. ciężkiej nadwrażliwości niewielkiego odsetka ludzi na pewne nanofarmaceutyki podawane dożylnie. Niezależnie od mechanizmu leżącego u podłoża, zgodność z objawami występującymi u ludzi (patrz niżej) sprawia, że model ten może służyć do identyfikacji zagrożenia reakcją nadwrażliwości na badany lek w przypadku pacjentów nadwrażliwych. Również pewne zmiany krążeniowo-oddechowe i inne zmiany fizjologiczne są ilościowe i wysoce powtarzalne w oknie dynamicznym testu, w którym reakcja niepożądana jest zależna od dawki. Pozwala to na wykorzystanie modelu do oceny ryzyka wywołania HSR przez badane leki, badania mechanizmu tych reakcji oraz opracowania metod ich zapobiegania.
Znaczenie kliniczne modelu CARPA u świń. Zgodnie z powyższymi stwierdzeniami dotyczącymi przydatności dla ludzi, nasze obserwacje w modelu świńskim wykazują znaczną zgodność z niektórymi danymi z ostatnich badań klinicznych. Mianowicie, badania „RADAR” i „REGULATE-PCI” z pegniwakoginą (zestaw Revolixys)42,43 zostały przerwane z powodu zagrażających życiu HSR. Badany PEGylowany aptamer wywołał anafilaksję u 3/640 (0,46%) i 10/1605 (0,62%) pacjentów, a reakcje obserwowano wyłącznie u tych, którzy mieli wysoki poziom wytworzonych wcześniej przeciwciał anty-PEG.42,43 Co ważne, wskazania do aktywacji dopełniacza (wzrost C33, wzrost C3 i wzrost C3 w surowicy) nie były w pełni wiarygodne (wzrost stężenia C3a, Bb, spadek CH50) obejmowały C4d, biomarker aktywacji dopełniacza na drodze klasycznej.42,43 Autorzy wspomnianego badania klinicznego, zgadzając się z wnioskami z niniejszej pracy, sugerują, że aktywacja dopełniacza wywołana przez przeciwciała anty-PEG Ab (tj. CARPA) jest podstawową przyczyną reakcji anafilaktycznych, choć przypisują ją raczej anty-PEG IgG niż anty-PEG IgM (której nie oznaczano). W innym badaniu klinicznym dotyczącym częstych i ciężkich HSR na peglotykazę (Krystexxa), rekombinowany enzym pochodzenia świńskiego (urykaza) zawierający PEG, stosowany w leczeniu opornej na leczenie podagry, wykazano, że HSR korelują z istniejącymi i indukowanymi anty-PEG Abs oraz szybką utratą skuteczności leku.14,44 Kolejnym świadectwem klinicznej przydatności modelu świńskiego jest niedawne zatwierdzenie przez FDA ukierunkowanego na transtyretynę małego inhibitora RNA zawierającego nanocząsteczki (patisiran, Onpattro), którego protokół bezpiecznego podawania został opracowany częściowo z wykorzystaniem świńskiego modelu CARPA.45
Perspektywa. Opisane w niniejszym artykule badanie dostarczyło doświadczalnego wsparcia dla koncepcji, że CARPA wywołana przez PEGylowane liposomy, której najgorszą manifestacją jest wstrząs rzekomoanafilaktyczny, przebiega wzdłuż osi układ dopełniacza - układ krążenia, poprzez ostrą kaskadową aktywację wrodzonej odporności humoralnej i komórkowej. Informacje te mogą pomóc w lepszym zrozumieniu, a co za tym idzie, skuteczniejszym przewidywaniu i zapobieganiu HSR na PEGylowane i inne nanofarmaceutyki. Ponadto, wymienione dowody zgodności pomiędzy fizjologicznymi i immunologicznymi odpowiedziami na nanocząstki PEGylowane u świń i ludzi, jak również przykład wykorzystania tego modelu przez przemysł biofarmaceutyczny, stanowią silne wsparcie dla ludzkiego znaczenia i wykorzystania świńskiego modelu CARPA do identyfikacji zagrożeń w badaniach przedklinicznych nad bezpieczeństwem.
MATERIAŁY I METODY:
Leki i substancje chemiczne. Komercyjny preparat Doxil (Caelyx) otrzymano z apteki Uniwersytetu Semmelweisa (w niniejszej pracy odnosimy się do preparatu Doxil, ponieważ obie nazwy oznaczają ten sam lek). Zawiera on doksorubicynę, 2 mg/mL (4,22 mM); całkowicie uwodornioną fosfatydylocholinę sojową (HSPC), 9,58 mg/mL; cholesterol, 3. 19 mg/ml; 2K-PEG-DSPE (eter metylowy N-karbamylopoly(glikolu etylenowego)- sól trietyloamoniowa 1,2-distearoilo-sn-glicerolo-3-fosforoetanoloaminy z cząsteczką glikolu polietylenowego o średniej masie cząsteczkowej 2000 Da, 3,19 mg/ml; siarczan amonu, ~0,2 mg/ml; histydyna (10 mM, pH 6,5); i sacharoza (10%). Całkowity fosfolipid: 12,8 mg/mL (13,3 mM). Cholesterol został zakupiony od Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, USA), mPEG2000-DSPE pochodził z NOF, a HSPC z Lipoid Inc. (Ludwigshafen, Niemcy). Czystość wszystkich lipidów wynosiła >97%. Zymosan, sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (PBS) bez Ca2+/Mg2+ i surowica cielęca wołowa oraz znakowane biotyną kozie poliklonalne anty-IgM pochodziły z Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Doksorubicyna pochodziła z TEVA Pharmaceuticals (Petach Tikva, Izrael). Streptawidyna-FITC pochodziła z firmy Molecular Probes. FACS Lysing solution i paraformaldehyd pochodziły z firmy BD. Zestaw MicroVue Pan C3 (Quidel Corp, nr kat . TECOMedical
(Sissach, Szwajcaria). Myszy monoklonalne IgM anty-PEG (ANPEG-1) otrzymano z ANP Technologies, Inc. (Newark, DE, USA).
Przygotowanie Doxebo. Sposób przygotowania i charakterystykę preparatu Doxebo opisano wcześniej.20 W skrócie, liofilizowane lipidowe składniki preparatu Doxil (wymienione powyżej) uwodniono w 10 mL sterylnego, wolnego od pirogenów normalnego roztworu soli przez worteksowanie przez 2-3 min w temperaturze 70°C w celu utworzenia pęcherzyków wielocząsteczkowych (MLVs). Pęcherzyki MLV były rozdrabniane przez filtry poliwęglanowe 0,4 i 0,1 μm w dwóch etapach, po 10 razy przez każdy, przy użyciu 10 mL wytłaczarki firmy Northern Lipids (Vancouver, Kolumbia Brytyjska, Kanada) w temperaturze 62 °C. Liposomy były zawieszone w 0,15 M NaCl/10 mM buforze histydynowym (pH 6,5). Rozkład wielkości (średnia Z: 81,17 nm) i stężenie fosfolipidów Doxebo (12,6 mg/mL) określono zgodnie z opisem.20 Σ abs|n = 1- PAP.
Oznaczanie zawartości endotoksyny bakteryjnej (LPS) w liposomach. Zawartość LPS w liposomach przygotowanych do badań oznaczano za pomocą testu limulus amebocyte lysate assay (PYROGENT Plus, Cambrex Bio Science, East Rutherford, NJ, USA), po rozpuszczeniu (96% etanol) i oddzieleniu (ultrafiltracja z użyciem membrany o grubości 20 kDa) lipidów od LPS. Kryteria akceptacji jako wolne od pirogenów wynosiły <0,5 EU/mL (0,01-0,25 ng LPS/mL).
Badania na świniach. Szczegóły i ocena świńskiego „modelu CARPA” zostały opisane w kilku wcześniejszych badaniach.17-20,44 W skrócie, samce mieszanej rasy Yorkshire/Hungarian White Landrace (2-3 miesiące, 18-22 kg) otrzymano z Animal Breeding and Nutrition Research Institute, Herceghalom, Węgry. Zwierzęta poddano sedacji za pomocą Calypsolu/Xilazyny, a następnie znieczulono izofluranem (2-3% w O2). Intubację przeprowadzano za pomocą rurek intubacyjnych w celu utrzymania drożności dróg oddechowych i umożliwienia kontrolowanej wentylacji, jeśli była konieczna. Zwierzęta oddychały spontanicznie podczas eksperymentów. Operację wykonywano po uprzedniej dezynfekcji skóry jodyną powidonową (10%). W celu dokonania pomiaru PAP wprowadzano do tętnicy płucnej przez prawą żyłę szyjną zewnętrzną cewnik Swan-Ganza (AI-07124, 5 Fr. 110 cm, Arrow Internat Inc.). Dodatkowe cewniki umieszczono w lewej tętnicy udowej w celu rejestracji systemowego ciśnienia tętniczego (SAP), w lewej żyle szyjnej zewnętrznej w celu podania soli fizjologicznej i leków oraz w lewej żyle udowej w celu pobrania próbek krwi.
Próbki badane (zawiesiny liposomów) i zymosan wstrzykiwano zwierzętom w postaci bolusa (<10 s) do tętnicy płucnej lub we wlewie przez lewą żyłę szyjną zewnętrzną. Eksperyment zazwyczaj obejmował wstrzyknięcie bolusa 0,1 mg PL/kg Doxebo, następnie podobnej dawkiDoxilu (0,1 mg PL/kg), potem większej dawkiDoxilu, a na koniec 0,1 mg/kg zymosanu jako kontroli pozytywnej. Na koniec eksperymentów zwierzęta uśmiercano Euthasolem i stężonym chlorkiem potasu.
Monitorowanie różnych zmian fizjologicznych podczas zabiegu CARPA. Pole powierzchni pod zmianą PAP i SAP (AUC) obliczano sumując wartości PAP i SAP mm Hg według wzoru: PAPn + PAPn+1 2, gdzie „n” oznacza czas, a „x” ostatnią minutę (zwykle 10) obserwacji. PAP0 to wartość PAP bezpośrednio przed leczeniem (równoważna z wartością wyjściową).
Obróbka wstępna (immunizacja, odczulanie) świń. Immunizacja Doxebo w dniu 0 polegała na infuzji Doxebo (0,1 mg PL/kg) u świń przez żyłę uszną (zawiesina w 20 mL soli fizjologicznej) z prędkością 1 mL/min w ciągu 20 min.
Próbki krwi. Próbki krwi do analizy Ab pobierano z żyły usznej przed leczeniem wstępnym, a następnie w różnych terminach określonych w Wynikach. Antykoagulację przeprowadzono za pomocą EDTA lub hirudyny, używając odpowiednich probówek z hirudyną lub K3-EDTA.
ELISA of Porcine sC5b-9. Oznaczanie sC5b-9 u świń wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem.46 W skrócie, płytki mikrotitracyjne pokryto mysim anty-ludzkim sC5b-9 ascites (klon aE11) i inkubowano przez 1 h z osoczem zawierającym 10 mM EDTA. Drugi Ab, biotynylowany mysi anty-ludzki C6 (Quidel A219), był barwiony streptawidyną z peroksydazą chrzanową (HRP) przy użyciu substratu ABTS i H2O2.
Test ELISA na obecność przeciwciał anty-PEG. Płytki Polysorp (Nunc) pokryto 1,25 ^g/basen DSPE-PEG2000 w 100 ^L buforu wodorowęglanowego (4,46 ^M) (pH ~9,0) przez noc w 4 °C, a następnie zablokowano studzienki 150 ^L PBS/0. 05% Tween-20 + 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w temperaturze 37 °C przez 1,5 h. Przed i po blokowaniu, studzienki przepłukiwano odpowiednio dwa i trzy razy 300 ^L buforu do płukania zawierającego PBS/0,05% Tween-20 przez 1 min. Próbki osocza z koagulatem EDTA były rozcieńczane w PBS/0,05% Tween-20 + 1%BSA w zakresie 10-19 500 razy i inkubowane w studzienkach przez 1,5 h37 °C, przy powolnym wytrząsaniu. Studzienki płukano pięciokrotnie 300 ^L buforu płuczącego przez 1 min. Po zabarwieniu 100 ^L przeciwciał anty-porcelanowych IgM (rozcieńczenie 2000X, Sigma) lub IgG (rozcieńczenie 800X, Sigma) sprzężonych zHRP przez 1 h, dołki przemywano ponownie pięciokrotnie buforem do przemywania, jak wspomniano powyżej. Przeciwciała barwiono przez inkubację z 100 ^L roztworu substratu (Neogen) zawierającego 3,3/,5,5/-tetrametylobenzydynę (TMB) i nadtlenek wodoru przez 15 min w ciemności. Reakcję zatrzymywano za pomocą 50 ^L 2 N H2SO4, a A450 odczytywano za pomocą czytnika Fluostar Omega 96-well plate reader (BMG Labtech, Ortenberg, Niemcy). Jednostkę miana zdefiniowano jako rozcieńczenie, przy którym OD skorygowane do ślepej próby wynosiło 0,1. Test ELISA został zwalidowany zgodnie z opisem w Informacjach pomocniczych (ryc. 1).
Wiązanie Doxilu z komórkami B IgM dodatnimi w śledzionie. Świnia immunizowana Doxebo (patrz wyżej) i świnia naiwna zostały uśmiercone 9 dni po immunizacji, a ich śledziony zostały usunięte do oceny cytometrycznej przepływu wiązania Doxilu z komórkami B anty-PEG IgM+. Zawiesiny jednokomórkowe z wycinków tkanki śledziony przygotowywano przez delikatną homogenizację w PBS Dulbecco's bez Ca2+/Mg2+ uzupełnionym 2% surowicą bydlęcą cielęcą i 2 mM EDTA. To ostatnie medium sterylizowano przez filtrację, a zawiesinę komórkową homogenizowano przez aspirację przez igłę 21 G. Komórki odwirowywano (20 °C, 500 g, 8 min), przemywano i zawieszano w podłożu w ilości 106 komórek/mL. Następnie inkubowano je ze znakowanym biotyną anty-IgM i Doxil przez 30 min w 4 °C. Po płukaniu, komórki znakowane IgM były barwione streptawidyną-FITC przez 20 min w temperaturze pokojowej (RT). Po wielokrotnym płukaniu, krwinki czerwone były lizowane roztworem FACS Lysing przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT). Na koniec, po ostatnim płukaniu, komórki zawieszano w 1% paraformaldehydzie. Analizę FACS przeprowadzono w aparacie FACScan (BD), a dane analizowano za pomocą oprogramowania Kaluza (Beckman Coulter). W probówkach do barwienia kontrolnego, komórki inkubowano bez Doxilu lub bez Doxilu i anty-IgM (tylko z biotyną-FITC).
Pomiar zużycia C3 u świń in vitro metodą ELISA. Surowice wieprzowe uzyskane od zwierzęcia naiwnego i immunizowanego (dzień 7) inkubowano z Doxil i zymosanem (stosunek objętości aktywatora do surowicy wynosił 1/3) przez 45 min w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Inkubacja została przerwana przez dodanie 10 objętości rozcieńczalnika do próbek ELISA uzupełnionego 10 mM EDTA, a próbki zostały zmierzone dla poziomu świńskiego C3 przy użyciu zestawu odczynnika MicroVue Pan-Specific C3 (Quidel Corp) zgodnie z instrukcjami producenta. Wartości z 45 min były porównywane z linią podstawową, tj. podobnymi próbkami analizowanymi bezpośrednio po zmieszaniu aktywatorów z surowicą (0 min). Zużycie obliczono jako 100 - (OD45 min/OD0 min X 100) gdzie OD45 min i OD0 min są absorbancjami przy długości fali 450 nm w określonym czasie.
Metody statystyczne. Normalność badano testem Kołmogorowa- Smirnowa. Miana anty-PEG Ab i wartości PAP we wszystkich punktach czasowych porównywano z wartościami wyjściowymi (0 min), a istotność różnic określano, odpowiednio, za pomocą nieparametrycznych testów Kruskala-Wallisa i Friedmana, a następnie wielokrotnych porównań Dunna. W celu zbadania korelacji między zmianami wartości sC5b-9 i wartości AUC PAP w odpowiedzi na leczenie Doxebo/Doxil 4-6 tygodni po immunizacji zastosowano analizę Pearsona, poprzedzoną testem normalności rozkładu i wartości odstających, odpowiednio testem Kołmogorowa-Smirnowa i Grubba. Za istotną statystycznie uznawano wartość P mniejszą niż 0,05. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą oprogramowania GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).
ZAWARTOŚĆ DODATKOWA: Informacje uzupełniające: Informacje pomocnicze są dostępne bezpłatnie na stronie ACS Publications pod adresem DOI: 10.1021/acsnano.9b03942.
Eksperymenty walidujące test ELISA z przeciwciałami anty-PEG; tabela z wykazem dowodów na to, że aktywacja dopełniacza odgrywa rolę w reakcjach nadwrażliwości wywołanych przez liposomy (PDF)
Wkład autorów: G.K., R.U., Y.B. i J.S. zaprojektowali eksperymenty, przeanalizowali dane i napisali pracę. G.K., T.M., D.I.V., L.D., E.Ó., RU. i Y.B. przeprowadzili eksperymenty, a R.L. pomagał w ich organizacji. Wszyscy autorzy omawiali postępy badań i recenzowali manuskrypt.
Wkład autorów: Y.B. i J.S. są równorzędnymi starszymi autorami.
Uwagi: Autorzy nie deklarują żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.
PODZIĘKOWANIA:
Autorzy przyznają następujące wsparcie finansowe: the Barenholz Fund (Izrael); the European Union Seventh Frame- work Program grant no. 309820 (NanoAthero) and no. 602923 (Theraglio); Węgierski Fundusz Badań Naukowych (OTKA/ NFKI) projekt K-113164, Applied Materials and Nano- technology Center of Excellence, Miskolc University; Norwegian Council on Cardiovascular Disease, the Ódd Fellow Foundation, the Simon Fougner Hartmann Family Fund oraz Siódmy Program Ramowy Wspólnoty Europejskiej w ramach umowy grantowej nr 602699 (DIREKT). Autorzy dziękują Marii Velkei za pomoc laboratoryjną.
PRZYPISY:
(1) Cheifetz, A.; Smedley, M.; Martin, S.; Reiter, M.; Leone, G.; Mayer, L.; Plevy, S. The Incidence and Management of Infusion Reactions to Infliximab: a Large Center Experience. Am. J. Gastro- enterol. 2003, 98, 1315-1324.
(2) Mayer, L.; Young, Y. Infusion Reactions and Their Management. Gastroenterol Clin North Am. 2006, 35, 857-866.
(3) Lenz, H. J. Management and Preparedness for Infusion and Hypersensitivity Reactions. Oncologist 2007, 12, 601-609.
(4) Vogel, W. H. Infusion Reactions: Diagnosis, Assessment, and Management. Clin J. Oncol Nurs 2010, 14, E10-E21.
(5) Ring, J.; Beyer, K.; Biedermann, T.; Bircher, A.; Duda, D.; Fischer, J.; Friedrichs, F.; Fuchs, T.; Gieler, U.; Jakob, T.; Klimek, L.; Lange, L.; Merk, H. F.; Niggemann, B.; Pfaar, O.; Przybilla, B.; Rueff, F.; Rietschel, E.; Schnadt, S.; Seifert, R.; et al. Guideline for Acute Therapy and Management of Anaphylaxis. AUergo J. Int. 2014, 23, 96-112.
(6) Ingen-Housz-Óro, S.; Pham-Ledard, A.; Brice, P.; Lebrun-Vignes, B.; Zehou, O.; Reitter, D.; Ram-Wolff, C.; Dupin, N.; Bagot, M.; Chosidow, Ó.; Beylot-Barry, M. Immediate Hypersensitivity Reaction to PEGylated Liposomal Doxorubicin: Management and Outcome in Four Patients. Eur. J. Dermatol 2017, 27, 271-274.
(7) Szebeni, J.; Simberg, D.; Gonzalez-Fernandez, A.; Barenholz, Y.; Dobrovolskaia, M. A. Roadmap and Strategy for Overcoming Infusion Reactions to Nanomedicines. Nat. Nanotechnol 2018, 13, 1100-1108.
(8) Doxil Prescribing Information. https://www.accessdata.fda.gov/ drugsatfda_docs/label/2007/050718s029lbl.pdf. Accessed July 17, 2019.
(9) Dadla, A.; Tannenbaum, S.; Yates, B.; Holle, L. Delayed Hypersensitivity Reaction Related to the Use of Pegfilgrastim. J. Oncol. Pharm. Pract. 2015, 21, 474-477.
(10) Davila Fajardo, C. L.; Pena Ortega, M.; Cabeza Barrera,J.; Prados Garrido, M. D. Methoxy Polyethylene Glycol-Epoetin Beta (Mircera) in the Treatment of a Patient with Chronic Kidney Disease Presenting Late-Onset Hypersensitivity to Other Epoetins. Nefrologia 2010, 30, 372-373.
(11) Jivi, A. Antihemophilic Factor (Recombinant), Prescribing Information. https://www.fda.gov/media/94470/download (accessed July 17, 2019).
(12) Palynziq (pegvaliase-pqpz), Prescribing Information.https:// www.palynziq.com/prescribinginformation.pdf (accessed July 17, 2019).
(13) Hermanson, T.; Bennett, C. L.; Macdougall, I. C. Peginesatide for the Treatment of Anemia Due To Chronic Kidney Disease - An Unfulfilled Promise. Expert Opin. DrugSaf. 2016, 15, 1421-1426.
(14) Calabrese, L. H.; Kavanaugh, A.; Yeo, A. E.; Lipsky, P. E. Frequency, Distribution and Immunologic Nature of Infusion Reactions in Subjects Receiving Pegloticase For Chronic Refractory Gout. Arthritis Res. Ther. 2017, 19, 191-197.
(15) Povsic, T. J.; Vavalle, J. P.; Aberle, L. H.; Kasprzak, J. D.; Cohen,
- G.; Mehran, R.; Bode, C.; Buller, C. E.; Montalescot, G.; Cornel, J. H.; Rynkiewicz, A.; Ring, M. E.; Zeymer, U.; Natarajan, M.; Delarche,
- ; Zelenkofske, S. L.; Becker, R. C.; Alexander, J. H. A Phase 2, Randomized, Partially Blinded, Active-Controlled Study Assessing The Efficacy and Safety of Variable Anticoagulation Reversal Using the REG1 System in Patients with Acute Coronary Syndromes: Results of the RADAR Trial. Eur. HeartJ. 2013, 34, 2481-2489.
(16) Szebeni,J.; Baranyi, L.; Savay, S.; Bodo, M.; Milosevits,J.; Alving, C. R.; Bunger, R. Complement Activation-Related Cardiac Anaphylaxis in Pigs: Role of C5a Anaphylatoxin and Adenosine in Liposome- Induced Abnormalities in ECG and Heart Function. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol 2006, 290, 1050-1058.
(17) Szebeni, J.; Bedocs, P.; Csukas, D.; Rosivall, L.; Bunger, R.; Urbanics, R. A. Porcine Model of Complement-Mediated Infusion Reactions to Drug Carrier Nanosystems and Other Medicines. Adv. Drug Delivery Rev. 2012, 64, 1706-1716.
(18) Urbanics, R.; Szebeni, J. Lessons Learned from the Porcine CARPA Model: Constant and Variable Responses to Different Nanomedicines and Administration Protocols. Eur. J. Nanomed. 2015, 7, 219-231.
(19) Szebeni, J.; Bedocs, P.; Dezsi, L.; Urbanics, R. A. Porcine Model of Complement Activation-Related Pseudoallergy to Nano-Pharma- ceuticals: Pros and Cons ofTranslation to a Preclinical Safety Test. Prec Nanomed 2018, 1, 63-73.
(20) Szebeni, J.; Bedocs, P.; Urbanics, R.; Bunger, R.; Rosivall, L.; Toth, M.; Barenholz, Y. Prevention ofInfusion Reactions to PEGylated Liposomal Doxorubicin via Tachyphylaxis Induction by Placebo Vesicles: a Porcine Model. J. Controlled Release 2012, 160, 382-387.
(21) Szebeni, J. Complement Activation-Related Pseudoallergy: a New Class of Drug-Induced Acute Immune Toxicity. Toxicology 2005, 216, 106-121.
(22) Szebeni, J. Complement Activation-Related Pseudoallergy: a Stress Reaction in Blood Triggered by Nanomedicines and Biologicals. Mol. Immunol. 2014, 61, 163-173.
(23) Moghimi, S. M. Nanomedicine Safety in Preclinical and Clinical Development: Focus on Idiosyncratic Injection/Infusion Reactions. Drug Discovery Today 2018, 23, 1034-1042.
(24) Wibroe, P. P.; Anselmo, A. C.; Nilsson, P. H.; Sarode, A.; Gupta, V.; Urbanics, R.; Szebeni, J.; Hunter, A. C.; Mitragotri, S.; Mollnes, T. E.; Moghimi, S. M. Bypassing Adverse Injection Reactions to Nanoparticles Through Shape Modification and Attachment to Erythrocytes. Nat. Nanotechnol. 2017, 12, 589-594.
(25) Szebeni, J. Mechanism ofNanoparticle-Induced Hypersensitivity in Pigs: Complement or Not Complement? DrugDiscovery Today 2018, 23, 487-492.
(26) Meszaros, T.; Kozma, G. T.; Shimizu, T.; Miyahara, K.; Turjeman, K.; Ishida, T.; Barenholz, Y.; Urbanics, R.; Szebeni, J. Involvement of Complement Activation in the Pulmonary Vasoactivity of Polystyrene Nanoparticles in Pigs: Unique Surface Properties Underlying Alternative Pathway Activation and Instant Opsonization. Int. J. Nanomed. 2018, 13, 6345-6357.
(27) Szebeni, J.; Baranyi, L.; Savay, S.; Lutz, H. U.; Jelezarova, E.; Bunger, R.; Alving, C. R. The Role of Complement Activation in Hypersensitivity to PEGylated Liposomal Doxorubicin (Doxil®). J. Liposome Res. 2000, 10, 467-481.
(28) Chanan-Khan, A.; Szebeni, J.; Savay, S.; Liebes, L.; Rafique, N. M.; Alving, C. R.; Muggia, F. M. Complement Activation Following First Exposure to PEGylated Liposomal Doxorubicin (Doxil): Possible Role in Hypersensitivity Reactions. Ann. Oncol 2003, 14, 1430-1437.
9323
(29) Orfi, E.; Meszaros, T.; Hennies, M.; Fulop, T.; Dezsi, L.; Nardocci, A.; Rosivall, L.; Hamar, P.; Neun, B. W.; Dobrovolskaia, M.
A.; Szebeni, J.; Szenasi, G. Acute Physiological Changes Caused by Complement Activators and Amphotericin B-Containing Liposomes in Mice. Int. J. Nanomed. 2019, 14, 1563-1573.
(30) Dams, E. T.; Laverman, P.; Oyen, W.J.; Storm, G.; Scherphof, G.
- ; van Der Meer, J. W.; Corstens, F. H.; Boerman, O. C. Accelerated Blood Clearance and Altered Biodistribution of Repeated Injections of Sterically Stabilized Liposomes. J. Pharmacol Exp Ther 2000, 292, 1071-1079.
(31) Ishida, T.; Harada, M.; Wang, X. Y.; Ichihara, M.; Irimura, K.; Kiwada, H. Accelerated Blood Clearance of PEGylated Liposomes Following Preceding Liposome Injection: Effects of Lipid Dose and PEG Surface-Densityand Chain Length ofthe First-Dose Liposomes. J. Controlled Release 2005, 105, 305-317.
(32) Koide, H.; Asai, T.; Hatanaka, K.; Akai, S.; Ishii, T.; Kenjo, E.; Ishida, T.; Kiwada, H.; Tsukada, H.; Oku, N. T Cell-Independent B Cell Response Is Responsible for ABC Phenomenon Induced by Repeated Injection of PEGylated Liposomes. Int. J. Pharm. 2010, 392, 218-223.
(33) Shimizu, T.; Mima, Y.; Hashimoto, Y.; Ukawa, M.; Ando, H.; Kiwada, H.; Ishida, T. Anti-PEG IgM and Complement System Are Required for the Association ofSecond Doses ofPEGylated Liposomes with Splenic Marginal Zone B Cells. Immunobiology 2015, 220, 1151 — 1160.
(34) Hashimoto, Y.; Shimizu, T.; Abu Lila, A. S.; Ishida, T.; Kiwada, H. Relationship between the Concentration of Anti-Polyethylene Glycol (PEG) Immunoglobulin M (IgM) and the Intensity of the Accelerated Blood Clearance (ABC) Phenomenon against PEGylated Liposomes in Mice. Biol. Pharm. Bull. 2015, 38, 417-424.
(35) Abu Lila, A. S.; Szebeni, J.; Ishida, T. Accelerated Blood Clearance Phenomenon and Complement Activation-Related Pseu- doallergy: Two Sides of the Same Coin. In Immune Effects of Biopharmaceuticals and Nanomedicines; Bawa, R.; Szebeni, J.; Webster, T.J.; Audette, G. F., Eds.; Pan Stanford Publishing Pte. Ltd.: Singapore, 2018; pp 771-800.
(36) Dezsi, L.; Fulop, T.; Meszaros, T.; Szenasi, G.; Urbanics, R.; Vazsonyi, C.; Orfi, E.; Rosivall, L.; Nemes, R.; Kok, R. J.; Metselaar, J.
- ; Storm, G.; Szebeni, J. Features of Complement Activation-Related Pseudoallergy to Liposomes with Different Surface Charge and PEGylation: Comparison of the Porcine and Rat Responses. J. Controlled Release 2014, 195, 2-10.
(37) Abu Lila, A. S.; Ichihara, M.; Shimizu, T.; Ishida, T.; Kiwada, H. Ex Vivo/In Vitro Anti-Polyethylene Glycol (PEG) Immunoglobulin M Production from Murine Splenic B Cells Stimulated by PEGylated Liposome. Biol. Pharm. Bull. 2013, 36, 1842-1348.
(38) Shimizu, T.; Abu Lila, A. S.; Awata, M.; Kubo, Y.; Mima, Y.; Hashimoto, Y.; Ando, H.; Okuhira, K.; Ishima, Y.; Ishida, T. A Cell Assay for Detecting Anti-PEG Immune Response against PEG- Modified Therapeutics. Pharm. Res. 2018, 35, 223-233.
(39) Skotland, T. Injection of Nanoparticles into Cloven-Hoof Animals: Asking for Trouble? Theranostics 2017, 7, 4877-4878.
(40) Moghimi, S. M.; Simberg, D. Translational Gaps in Animal Models ofHuman Infusion Reactions to Nanomedicines. Nanomedicine (London, U. K.) 2018, 13, 973-975.
(41) Moghimi, S. M.; Simberg, D.; Skotland, T.; Yaghmur, A.; Hunter, C. The Interplay Between Blood Proteins, Complement, and Macrophages on Nanomedicine Performance and Responses. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2019, 370.
(42) Ganson, N. J.; Povsic, T. J.; Sullenger, B. A.; Alexander, J. H.; Zelenkofske, S. L.; Sailstad, J. M.; Rusconi, C. P.; Hershfield, M. S. Pre- Existing Anti-Polyethylene Glycol Antibody Linked to First-Exposure Allergic Reactions to Pegnivacogin, a PEGylated RNA Aptamer. J. Allergy Clin. Immunol. 2016, 137, 1610-1613.
(43) Povsic, T. J.; Lawrence, M. G.; Lincoff, A. M.; Mehran, R.; Rusconi, C. P.; Zelenkofske, S. L.; Huang, Z.; Sailstad, J.; Armstrong, P. W.; Steg, P. G.; Bode, C.; Becker, R. C.; Alexander, J. H.; Adkinson, N. F.; Levinson, A. I. Pre-Existing Anti-Polyethylene Glycol Antibodies Are Associated with Severe Immediate Allergic Reactions to Pegnivacogin, a PEGylated Aptamer. J. Allergy Clin. Immunol. 2016, 138, 1712-1715.
(44) Hershfield, M. S.; Ganson, N. J.; Kelly, S. J.; Scarlett, E. L.; Jaggers, D. A.; Sundy, J. S. Induced and Pre-Existing Anti-Polyethylene Glycol Antibody in a Trial of Every 3-Week Dosing of Pegloticase for Refractory Gout, Including in Organ Transplant Recipients. Arthritis Res. Ther 2014, 16, R63-73.
(45) Kasperovic, P. Dosages and Methods for Delivering Lipid Formulated Nucleic Acid Molecules. U.S. patent application 20160122759, 2016.
(46) Jansen, J. H.; Hogasen, K.; Mollnes, T. E. Extensive Complement Activation in Hereditary Porcine Membranoproliferative Glomerulo- nephritis Type II (Porcine Dense Deposit Disease). Am.J. Pathol 1993, 143, 1356-1365
